Dal giugno 2003 fino al marzo 2006, l'Acquario è stato chiuso al pubblico per importanti lavori di ristrutturazione, progettati dagli architetti Piero De Amicis e Luigi Maria Guffanti con il coordinamento scientifico del direttore Mauro Mariani. L'acquario è stato riaperto al pubblico il 1 aprile 2006 dopo tre anni di importanti e attenti restauri che hanno reso l'edificio liberty più ampio, moderno e funzionale, completamente rinnovato nella struttura e nel percorso espositivo. Con il nuovo progetto le superfici disponibili sono quasi duplicate. L'atrio è più che raddoppiato e i piani da due sono diventati tre grazie al recupero dei vecchi sotterranei. Allargati, resi agibili e fruibili da tutti i visitatori, ospitano il bookshop e la caffetteria, ambienti confortevoli e ormai abituali per musei e luoghi di cultura. Da qui scale e ascensori conducono al piano superiore, sede degli uffici, della prestigiosa biblioteca (una delle più ricche del settore della biologia marina e dell'idrobiologia) dell'auditorium/sala convegni che tornerà a essere il centro delle molte manifestazioni promosse dall'Acquario. Assoluta novità del primo piano sono alcuni spazi a disposizione del pubblico: un "giardino d'inverno", al centro dell'edificio, e la balconata affacciata su Parco Sempione e sulle vasche esterne. Particolare attenzione è stata dedicata alla scenografia e alle realizzazioni di grande suggestione e forte impatto come la vasca a ponte. Ampi spazi, infine, sono dedicati agli ambienti per le attività espositive temporanee su temi e aspetti specifici, in connessione con aree riservate alla didattica e all'attività culturale. Completamente rinnovato anche il percorso espositivo incentrato sul tema del percorso dell'acqua: dai torrenti d'alta montagna, al lago, alla foce del Po e all'ambiente di laguna che fa da collegamento ideale con le vasche marine. Strutture innovative per Milano e suggestive, come quella che ricostruisce un relitto sommerso e quella a ponte, che grazie a una copertura trasparente, permette ai visitatori di essere circondati e sovrastati dagli abitanti del mondo marino. Non mancano note esotiche, rappresentate da una grande vasca dedicata al mare tropicale a noi più vicino, il Mar Rosso. Ogni vasca è caratterizzata dalla sua altitudine rispetto al livello del mare. Tra gli elementi innovativi, tre vasche aperte in cui il pubblico può osservare gli ambienti ricostruiti come se fosse all'interno di essi senza alcuna barriera. La gestione parzialmente computerizzata permette di monitorare più attentamente gli ambienti, comprese le variazioni del giorno, della notte e delle stagioni, per garantire le condizioni ottimali di vita agli organismi.